體外培養細胞的條件模擬

細胞在體外能否生存以及生活質量的好壞嚴格依賴於所提供的這種人工模擬環境是否與體內的生理環境一致或相似。概括說來，這種人工模擬的生存環境主要包括營養、溫度、滲透壓、pH等幾方面的因素。
（一）營養需求
體外培養細胞時，營養需求是滿足其生存、生長增殖的首要條件。而細胞培養基便是在體外培養細胞時供給細胞營養和促使細胞生長增殖的基礎物質。
1．細胞對營養的需求 離體培養細胞對營養的需求基本上與在體相同，主要包括氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、蛋白質、脂類等幾個方面。
（1）氨基酸既是細胞合成蛋白質的原料，也是細胞重要的能量來源，氨基酸的種類及數量影響着細胞的密度、增殖、活力等諸多方面。幾乎所有的細胞均需要下列12種氨基酸：精氨酸、纈氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、胱氨酸。
（2）用於細胞培養糖類物質主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最為多用。糖類物質是細胞最主要的能量來源，同時也是生物合成核酸、氨基酸、脂類物質重要的碳源。
（3）無機鹽對於基礎培養基滲透壓的調節至關重要，同時還對細胞跨膜電位的調節、細胞附着以及一些酶的活性調節具有重要作用。經常添加的無機鹽離子主要有鈉、鉀、鎂、磷、鈣等。
（4）維生素是諸多細胞代謝活動重要的輔酶，嚴重影響着細胞的活力與增殖。生物素、葉酸、煙酰胺、核黃素、維生素C、維生素B12、吡哆醇等都是培養基需要添加的成分，尤其以B族的維生素常見。
（5）血清是一個包含大量蛋白以及多種生長因子、激素、氨基酸、糖、胰蛋白酶抑制劑、脂類物質、無機鹽、微量元素等的非常複雜的混合物。最常用的血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum，NCS）、小牛血清（calf serum，CS）、馬血清、豬血清以及人血清。
（6）脂肪酸和脂類物質也常有血清提供，尤其被一些特定的細胞系所必需。例如，用於培養膽固醇依賴的雜交瘤的培養基就需要添加一定量膽固醇。
（7）微量元素常被添加給那些無血清培養基，以彌補因未添加血清所造成的微量元素缺失或不足，主要有鋅、銅、硒等。其中硒對於清除培養基中的由代謝產生的自由基具有重要作用。
2．培養基 用於細胞培養的培養基的種類很多，按其物質狀態分為半固體培養基和液體培養基兩類；按其來源分為天然培養基和合成培養基。
（1）天然培養基：在細胞培養技術發展的早期，所用的細胞培養基多是來自於淋巴液、血漿、血清以及各種組織提取液，常被稱為天然培養基。目前最普遍使用的天然培養基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最為常見。但這種天然的培養基常被作為添加劑與合成培養基合用，常見的血清添加比例為5%～20%。
（2）合成培養基：是在對細胞培養時所需各種營養仔細研究的基礎之上，根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配製而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量元素和細胞生長因子等。①基本培養基。早期研製的合成培養基單獨使用雖能使細胞生存但往往不能很好的生長增殖，需要添加一定量的血清才能成為真正的「完全培養基」，故常將其稱為基本培養基，常見的MEM、DMEM、RPMI1640、199等均屬此類；②無血清培養基。無血清培養基是一種不需要添加血清就可維持培養細胞存活、生長、增殖的合成培養基。③無蛋白培養基。目前，這種無蛋白培養基的研製是對通過添加植物水解物來代替動物激素、生長因子等的作用來飼養細胞的；④限定化學成分培養基。限定化學成分培養基同樣是一種不含動物蛋白的培養基，和無蛋白培養基不同點在於其沒有添加植物水解物，而是使用了一些已知結構和功能的小分子化合物。因此，這種培養基的所有成分都是明確的，是目前研究細胞分泌產物的一種最佳培養基。
（二）溫度
體外培養的細胞需要在一定的溫度條件下才能存活，不同細胞適宜的培養溫度常由動物種類所決定。比如，哺乳類動物細胞包括人類細胞的理想培養溫度多在36℃～37℃；鳥類細胞適宜的培養溫度在38.5℃；昆蟲細胞的培養溫度在25℃；冷血脊椎動物的培養溫度在18℃～25℃。
培養溫度的不適當會嚴重影響細胞的存活及生長狀態。通常，細胞對低溫可有較長時間的忍耐限度，甚至可在低於適宜溫度一定範圍內生長，但如果培養溫度高於適宜溫度時（如在39℃條件下培養人類細胞），細胞常會在幾h內便死亡。因此，定期檢查細胞培養箱的溫度非常重要。
（三）滲透壓
離體的細胞必須生長在等滲的液體環境中才能維持細胞的正常形態結構，並有助於細胞對出入細胞的物質進行調控。滲透壓的大小主要由培養基中各種鹽成分的濃度決定。儘管大多數細胞對滲透壓都有一定的耐受性，但適宜的滲透壓常會因細胞的種類及物種來源不同而異。例如，培養人類細胞的理想滲透壓為290 mOsm/kg；培養大多數哺乳類動物細胞的理想滲透壓多在260¬mOsm/kg～320 mOsm/kg範圍內；培養小鼠細胞的理想滲透壓多在320 mOsm/kg左右。
（四）氣相及pH
體外培養的細胞對氣體環境也有一定的要求。多數細胞在培養時需要O2的存在，但O2的分壓多維持在略低於大氣中的O2分壓的水平，這是因為過高的O2分壓會造成細胞的損傷。CO2也是細胞培養所需要的，其與培養基pH值的維持密切相關，CO2濃度的升高會引起培養基pH值降低。體外培養細胞時的氣體環境常由95％的空氣和5％的CO2構成，針對培養對象的不同，CO2的濃度常在2％～10％之間變化。
適宜大多數細胞生長的培養基pH多維持在7.0-7.4之間，而細胞在培養過程中所釋放出的代謝產物尤其是CO2會造成培養基pH值的迅速下降，很不利於細胞的繼續生長。為了儘可能長時間的將培養基的pH值穩定在適當範圍，常藉助CO2－碳酸氫鹽緩衝體系或有機緩衝體系（如HEPES）來解決這一問題。下面的反應式可以用來說明CO2-碳酸氫鹽緩衝體系的作用原理。
NaHCO3 + H2O ←→ Na+ + OH- + H2O+CO2↑
上式說明，只要維持CO2的濃度處於一個相對恆定的狀態，上述反應就會保持平衡，此時培養基中的OH-的濃度也就會相對穩定，換言之，培養基的pH也相對恆定。同時，這也是為什麼在培養細胞時要維持一定濃度CO2的重要原因之一。
（五）無毒無污染
體外培養的細胞必須生長在無毒無污染的環境中，這時因為體外生長的細胞一般情況下對有毒有害物質無任何解毒能力，抵抗力也極差。細胞毒性物質的存在常會導致培養細胞的死亡。
除有毒化學物質的污染危害外，細菌等微生物的污染，以及不同細胞間的交叉污染也是細胞培養時必須要避免的事情。可通過嚴格的過濾除菌或滅菌處理，並使用抗生素來降低污染的發生機率。在細胞培養中最常使用的抗生素是青黴素（常用濃度是25µg/ml ～100µg/ml）與鏈黴素（25μg/ml ～100μg/ml）。
不同類型細胞間的交叉污染主要由操作不當引起，在對不同細胞進行操作時應避免使用同一瓶培養基或使用同一個吸管。