体外培养细胞的条件模拟

细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来，这种人工模拟的生存环境主要包括营养、温度、渗透压、pH等几方面的因素。
（一）营养需求
体外培养细胞时，营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。
1．细胞对营养的需求 离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同，主要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。
（1）氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料，也是细胞重要的能量来源，氨基酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所有的细胞均需要下列12种氨基酸：精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。
（2）用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最为多用。糖类物质是细胞最主要的能量来源，同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类物质重要的碳源。
（3）无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要，同时还对细胞跨膜电位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离子主要有钠、钾、镁、磷、钙等。
（4）维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶，严重影响着细胞的活力与增殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B12、吡哆醇等都是培养基需要添加的成分，尤其以B族的维生素常见。
（5）血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum，NCS）、小牛血清（calf serum，CS）、马血清、猪血清以及人血清。
（6）脂肪酸和脂类物质也常有血清提供，尤其被一些特定的细胞系所必需。例如，用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。
（7）微量元素常被添加给那些无血清培养基，以弥补因未添加血清所造成的微量元素缺失或不足，主要有锌、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代谢产生的自由基具有重要作用。
2．培养基 用于细胞培养的培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为天然培养基和合成培养基。
（1）天然培养基：在细胞培养技术发展的早期，所用的细胞培养基多是来自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液，常被称为天然培养基。目前最普遍使用的天然培养基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用，常见的血清添加比例为5%～20%。
（2）合成培养基：是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上，根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。①基本培养基。早期研制的合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖，需要添加一定量的血清才能成为真正的“完全培养基”，故常将其称为基本培养基，常见的MEM、DMEM、RPMI1640、199等均属此类；②无血清培养基。无血清培养基是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。③无蛋白培养基。目前，这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的；④限定化学成分培养基。限定化学成分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基，和无蛋白培养基不同点在于其没有添加植物水解物，而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此，这种培养基的所有成分都是明确的，是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基。
（二）温度
体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活，不同细胞适宜的培养温度常由动物种类所决定。比如，哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多在36℃～37℃；鸟类细胞适宜的培养温度在38.5℃；昆虫细胞的培养温度在25℃；冷血脊椎动物的培养温度在18℃～25℃。
培养温度的不适当会严重影响细胞的存活及生长状态。通常，细胞对低温可有较长时间的忍耐限度，甚至可在低于适宜温度一定范围内生长，但如果培养温度高于适宜温度时（如在39℃条件下培养人类细胞），细胞常会在几h内便死亡。因此，定期检查细胞培养箱的温度非常重要。
（三）渗透压
离体的细胞必须生长在等渗的液体环境中才能维持细胞的正常形态结构，并有助于细胞对出入细胞的物质进行调控。渗透压的大小主要由培养基中各种盐成分的浓度决定。尽管大多数细胞对渗透压都有一定的耐受性，但适宜的渗透压常会因细胞的种类及物种来源不同而异。例如，培养人类细胞的理想渗透压为290 mOsm/kg；培养大多数哺乳类动物细胞的理想渗透压多在260¬mOsm/kg～320 mOsm/kg范围内；培养小鼠细胞的理想渗透压多在320 mOsm/kg左右。
（四）气相及pH
体外培养的细胞对气体环境也有一定的要求。多数细胞在培养时需要O2的存在，但O2的分压多维持在略低于大气中的O2分压的水平，这是因为过高的O2分压会造成细胞的损伤。CO2也是细胞培养所需要的，其与培养基pH值的维持密切相关，CO2浓度的升高会引起培养基pH值降低。体外培养细胞时的气体环境常由95％的空气和5％的CO2构成，针对培养对象的不同，CO2的浓度常在2％～10％之间变化。
适宜大多数细胞生长的培养基pH多维持在7.0-7.4之间，而细胞在培养过程中所释放出的代谢产物尤其是CO2会造成培养基pH值的迅速下降，很不利于细胞的继续生长。为了尽可能长时间的将培养基的pH值稳定在适当范围，常借助CO2－碳酸氢盐缓冲体系或有机缓冲体系（如HEPES）来解决这一问题。下面的反应式可以用来说明CO2-碳酸氢盐缓冲体系的作用原理。
NaHCO3 + H2O ←→ Na+ + OH- + H2O+CO2↑
上式说明，只要维持CO2的浓度处于一个相对恒定的状态，上述反应就会保持平衡，此时培养基中的OH-的浓度也就会相对稳定，换言之，培养基的pH也相对恒定。同时，这也是为什么在培养细胞时要维持一定浓度CO2的重要原因之一。
（五）无毒无污染
体外培养的细胞必须生长在无毒无污染的环境中，这时因为体外生长的细胞一般情况下对有毒有害物质无任何解毒能力，抵抗力也极差。细胞毒性物质的存在常会导致培养细胞的死亡。
除有毒化学物质的污染危害外，细菌等微生物的污染，以及不同细胞间的交叉污染也是细胞培养时必须要避免的事情。可通过严格的过滤除菌或灭菌处理，并使用抗生素来降低污染的发生机率。在细胞培养中最常使用的抗生素是青霉素（常用浓度是25µg/ml ～100µg/ml）与链霉素（25μg/ml ～100μg/ml）。
不同类型细胞间的交叉污染主要由操作不当引起，在对不同细胞进行操作时应避免使用同一瓶培养基或使用同一个吸管。