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分析細胞學技術
分析細胞學是從定量的角度對細胞的各種形態學參數、生物學特徵、細胞生化成分的組成及含量以及細胞的各種功能等進行研究，將以往各種細胞學技術從定性、定位進一步發展到定量的研究，獲得定量的測量數據，以更客觀地揭示生命活動的規律。分析細胞學技術的發展有兩個主要領域，固定式細胞分析和流動式細胞分析。固定式細胞分析是指細胞樣品固定在載玻片或培養皿上，通過顯微鏡，由成像系統獲取圖像，定量分析細胞的形態學參數和細胞內一些生化成分的含量。常用儀器有顯微分光光度計、圖像分析系統和雷射掃描共聚焦顯微鏡。流動式細胞分析要求將細胞樣品懸浮在液體中，這些細胞懸液加入儀器後，高速度地流過儀器的檢測區，儀器檢測懸液中每一個細胞，並進行分析測定，記錄每一個細胞眾多的生物學參數，並可根據預選的條件將其中特殊的細胞亞群分選純化出來，以供進一步的深入研究，這類儀器統稱為流式細胞儀。以下對流式細胞分析技術、顯微分光光度計和圖像分析系統作簡要介紹。雷射掃描共聚焦顯微鏡已在顯微鏡技術一節介紹。
一、流式細胞分析技術
流式細胞儀（flow cytometer，FCM ）從原理上講是一種在計算機技術支持下的高度自動化的細胞顯微螢光脈衝分光光度儀，它是結合雷射技術、光電測量技術、數字計算機技術和螢光細胞化學技術的產物，是分析細胞學領域的重要儀器。流式細胞術是一種對懸液中單個細胞或細胞器進行高速測量和自動分析的測量技術，每秒能測量數萬個細胞並多參數檢測，還能在分析的同時分選出有指定特徵的細胞。
（一）流式細胞儀的結構與原理
流式細胞儀的一般結構可分為三個部分，細胞流動室和液流驅動系統；激發光源及其光束成形系統；細胞信號檢測和分析系統（圖2－10）。這三部分在儀器中一般按三個互為垂直的軸線安置，即X軸方向的激發光軸線、Y軸方向的細胞螢光信號檢測軸線和 Z軸方向的細胞流軸線。此三個軸線的交點即為儀器的細胞信號檢測區。樣品中的每一個細胞必須按順序依次以相同的速度和軌跡通過此檢測區。每一細胞沿Z軸流經檢測區時，受到激發光照射。細胞受光照時產生細胞的散射光信號與螢光信號，這些細胞信號由檢測器收集，經計算機軟體分析處理，這就是流式細胞分析。
流動室是流式細胞儀的核心部件，它採用液體動力學分層鞘流技術，層流技術保證樣品中的每一細胞都沿流動室的中心軸運動，實現了每一細胞以相同的速度、相同方向、相同的軌跡逐個依次通過檢測區，流動室也可稱為單細胞流發生器。雷射是一種單色性、方向性、相干性好的高強度光源，是細胞微弱螢光快速分析的理想光源。流式細胞儀的激發光源通常採用有多條可調諧的輸出譜線的氬離子氣體雷射器，它能與多種螢光染料激發譜匹配。在實際應用時，一般採用單譜線488波長作為激發光源。檢測器採用多通道光電倍增管，由數字顯示器和示波器實時顯示各種信號波形及數據參數，結果由計算機分析處理。
流式細胞儀分選裝置一般由超聲振動器、液滴充電電路、靜電高壓偏轉場等組成。細胞分選是在細胞分析的基礎上進行的，經確認需要分選的細胞，在該細胞到達液流斷離端的即刻，由液滴充電電路發出一個充電脈衝，保證該包含有要分選細胞的液滴斷離後帶有靜電荷。帶電液滴向下運動經過高壓偏轉電場時，在靜電力的作用下偏離原運動軌跡。帶正電荷的液滴偏向負極，帶負電荷的液滴偏向正極。靜電高壓值一般是固定的，調節充電脈衝幅度，改變液滴荷電多少，可改變充電液滴的偏轉角和偏轉距離。分選所得的細胞可以用玻片、試管、96孔板等進行收集,結合分選後的細胞培養、細胞形態學觀察、細胞圖像分析等結果，可以綜合單個細胞的更多信息，這是其他細胞學技術難以實現的。
流式細胞儀中被測樣品的細胞，流經儀器檢測區時受到激發光的照射，激發光與細胞相互作用後可產生散射光信號和螢光信號。散射光信號是指激發光與細胞相遇作用後反射、折射、衍射等綜合的結果，它能反映細胞群體及其不同亞群形態學的一些信息，並且不依賴細胞樣品的螢光染色過程。螢光信號主要是指經過特異螢光染色後細胞受照發射的螢光信號。各種特異螢光染色方法是針對細胞內各種不同的生化成分或各種特異抗原等設計的。每一種螢光染色方法中必須用到一種或多種的螢光染料。由於每一種螢光分子結構不同，考慮螢光激發譜與螢光發射譜的接受時，通常要注意選擇合適的激發光源和各類分束濾色片。流式細胞術為了保證獲得準確的測試分析結果必須進行必要的質量控制，選用標準螢光微球和固定的雞血細胞是最常用的儀器參考標準。
（二）流式細胞術樣品製備
流式細胞術要做高精度的單細胞定量分析，對細胞樣品的製備技術有著特殊的要求。一般包括單細胞懸液的製備和細胞螢光染色。
1．單細胞懸液的製備
流式細胞術的分析檢測建立在單個細胞的基礎上，製備合格的單個分散的細胞懸液是非常關鍵的一環。對不同來源和不同形式的樣品，根據各種樣品的特點可選擇不同的分散方法。
（1） 單層培養細胞、血液、各種脫落細胞等樣品，標本經過簡單的製備懸液，離心分離處理，就可以得到分散較好的單個細胞懸液，是理想的流式細胞術檢測對象。
（2） 對於不同組織來源的實體組織標本，採用酶消化法、機械法和化學試劑處理法來分散細胞。
（3） 石臘包埋組織單細胞懸液的製備，可使大量存檔的臨床資料重新得到研究與利用，從而擴大了流式細胞術的應用範圍。樣品製備一般通過切片、脫脂、水化、消化及終止消化後過濾再收集細胞懸液，去除碎片的單細胞懸液用70%酒精固定保存。
流式細胞術所測的細胞樣品要求細胞呈單個分散狀態，其中細胞團塊，細胞碎片儘可能少，分散過程中細胞的活性不受到明顯的損害，以保證下一步的螢光染色處理。所以在實際應用時，一個理想的單個細胞分散的細胞懸液樣品的製備往往是兩種或多種方法的結合使用，才能獲得理想的細胞懸液。
2. 細胞的螢光染色
流式細胞術快速分析單細胞的各種生物學特性和各種生化成份並定量測定這些參數是通過螢光細胞化學方法實現的。與光鏡下或電鏡下的細胞化學方法一樣，對細胞內的每一種生化成份都可以找到其特異的螢光細胞化學染色方法。由於流式細胞術所需求的螢光細胞化學過程必須在細胞懸液中進行，因而又有其特點。細胞螢光染色必須選擇適當的螢光探針。螢光細胞化學過程要求有足夠的特異性，即所用螢光染料與所感興趣的細胞成份是否為特異性結合，嚴格控制各種反應條件是保證反應特異性的重要因素。染料的螢光光譜和量子產率是受環境因素影響的，在相同的條件下，螢光反應產物的產率（螢光強度）與所研究的生化成份的含量或活性之間有嚴格的化學定量關係，因此足夠的特異性和可靠的定量關係是螢光細胞化學過程的兩個基本評價標準。
現在螢光探針已有幾千種，正確選擇螢光探針是首要工作。常用螢光探針有細胞活性探針，有活細胞螢光探針和死細胞探針之分；膜螢光探針主要用於生物膜以及脂質轉運和代謝動力學研究，較多地用於膜融合和脂質轉移的觀察；離子膜探針有陰離子型膜探針，大多數探針螢光基團標記在脂肪酸的烷基上，陽離子型膜探針較易定位在胞膜，可檢測膜表面積和細胞體積的改變，中性膜探針包括非極性和兩性探針，有可能對膜有特異的親和力；細胞器探針能夠滲透到細胞內，選擇性地與細胞中的細胞器結合的螢光物質，實質上就是螢光染料；位點特異性探針是指可選擇性地與生物大分子相結合或進入細胞內與某些特異位點相結合，來研究細胞內外結構及其活性的探針；胞內離子探針利用螢光檢測細胞內各類離子濃度，包括Ca2+、Mg2+、Na+、和H+ 等，其它還有可溶性螢光探針、核酸螢光探針、電位敏感性螢光探針、底物螢光探針和籠鎖化合物螢光探針等。
目前，流式細胞術廣泛應用於細胞含量測定、核型分析、細胞凋亡檢測、細胞免疫表型分析、細胞因子檢測和細胞分選等方面，應用範圍在不斷地擴大。
二、顯微分光光度術
顯微分光光度術（microspectrophotometry， MSP）實質上是顯微鏡技術和分光光度技術的結合。它以物質分子的光吸收、螢光發射和光反射特性作為測量基礎，可以對細胞內的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白質等）的含量進行定量測試，是組織化學和細胞生物學中定量研究的必不可少的工具。
顯微分光光度計由主控計算機、多功能顯微鏡、透射和落射光源、單色儀、高精度掃描台和光電倍增管等構成。常用測量方法有顯微螢光光度術（Microfluorometry）、顯微密度術（Microdensitometry）、細胞光度術（Cytophotometry）顯微反射光度測量及波長掃描測量等。與通常的生化定量方法相比，用顯微光度術測定物質含量的主要優點是所用材料少，在同一塗片上測得多個參數；結合形態學特點，可選擇測定單個細胞或細胞器內的多種物質及細胞的代謝產物，同時可將測量光欄定位於細胞的某一部位或細胞器中；整個測量不需複雜的純化過程，能在短時內測得結果，便於觀察藥物作用對細胞活性改變的影響
顯微吸收光度術測量
顯微吸收光度法時一種光度測量的化學方法，它基於細胞內的蛋白質、多糖、核酸、脂類和酶染顆粒能在不同等電點下電離出不同側基，因而造成對染料親和力不同，應用不同的化學試劑染色，可使不同的細胞組分染上不同的顏色，在顯微鏡下成為可見的結構。染料於組分的結合必須是特異性的，即染料、細胞組分結合物的光吸收是遵循朗伯-比爾定律，而且染色深淺與被染細胞組分之間呈化學劑量學關係，符合這兩者關係的樣本就可應用吸收測量法，通過光檢測器（可使光能變成電能）測量有色化合物吸收單色光的量。
當光束通過固體液體或氣體介質時，常有部分光被吸收轉換成其他形式的能量。物質的光吸收和光波長有關，其吸收能力可通過測定入射光經測量區域的前後光強度換算出光密度來定量分析，它的吸收特性必須遵循朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律。
朗伯-比爾定律規定，當單色的平行光通過均勻溶液時，溶液的吸收能力和溶液的路程長度及溶質濃度成正比。可通過消光度A來確定。
A=-lgT=lgIo/I=K·C·L
式中T為溶液透光率，Io和I分別為入射光強和透射光強，K為吸收常數，C為吸光溶質濃度，L為光程。
由於光強度比較容易測量，經單色儀或干涉濾光片能得到單色光，顯微鏡近軸區的照射光近似於平行光，所以凡在塗片切片中含有吸光特性的物質,理論上均可採用吸收光度法測量。動植物中許多天然有色物質如肌紅蛋白、血紅蛋白、細胞色素c等，可用吸收光度法測含量；組織化學法染色的完整細胞的塗片如DNA的福爾根染色，可用該方法測量胞核DNA相對含量；還可用該法進行各類酶標的定量測量，對蛋白質進行干擾校正後在天然吸收基礎上測定核酸含量。
顯微吸收光度測量需滿足朗伯-比爾定律條件，待測物質需為均質，但生物學物質很少是均質的，而且顯微鏡成像過程中，經過光路系統各界面多次折射反射後會導致測量中的分布誤差、閃爍誤差、系統誤差等，影響測量精度。所以除校正系統至最佳狀態外，常用雙波長法、一波二區法和掃描法來消除誤差。掃描法是最令人滿意的方法。測量時，先將待測物分成大量小區域，近似認為每個小區域內物質分布為均質，採用順序逐點掃描法測出各小區域的消光度，經積分後換算出待測物的總消光度，求得其相對含量。掃描法根據不同掃描方式可分為：飛點掃描、像掃描、物掃描、TV掃描等。在實際測量時，台物掃描是最常用的方法，在高精度掃描台上放好樣品，確定其掃描範圍和波長，根據放大倍數確定測量光欄的大小，根據待測物確定單色入射光波長，選取全自動掃描後由計算機數據處理並顯示結果及掃描圖形。台物在x方向和y方向上來回移動，而測量光欄位置不動，使台上的被測物質各小區域依序進入測量光欄內而被測量；也可用影象掃描，台物不動，測量光欄的象在台物上沿x方向和y方向來回移動，掃描測量重複性好，準確性和靈敏度高，測量精度可達10-9g，可方便地進行細胞內細微結構的分析，區分不同細胞類型的差別。
（二）顯微螢光光度測量
定量顯微螢光光度測量是組織化學和細胞化學中的另一種重要技術，可通過測試固定組織細胞內的螢光反應物來對生物學標本進行定量分析。螢光種類有物質的自發螢光或是用螢光染料對某些生物學物質作特選染色後產生的繼光螢光。
與吸收光度測量相比，顯微螢光光度測量有許多明顯的優點。一般螢光測量所用染料濃度遠比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足夠暗時可對低濃度螢光物質高度敏感，可測量細胞內分散的微小顆粒。螢光物質本身是自發光體，無論測量孔徑內物體形狀規則與否，物質分布均勻與否，物體輻射的光量子在光電倍增管上都產生同樣的效應，所以無需掃描測量就可避免分布誤差。通過選取適當的激發波長和發射波長的譜線和寬度，可以做到高特異性的測量，通常顯微分光光度計選用適當的窄帶濾色片來獲取所需螢光波長，高精度的顯微分光光度計採用光柵單色儀，可獲得5nm帶寬的激發波長和檢測波長。螢光光度螢光測量方法分有堵塞法和掃描光度法，測量多數採用堵塞法，選取足夠大的測量光欄對待測物作總體螢光量測定，樣品由計算機定位，可快速測量，適於大樣本分析。螢光光度測量缺點是：螢光易衰減，有漂白作用，有時會猝滅，還必須減去本底螢光值。因此測量時要提高信噪比，必須掌握適當的激發時間和合適的螢光標準。
三、圖像分析系統
圖像分析（image analysis，IA）是分析細胞學中主要測量手段之一，常用於細胞形態分析、腫瘤細胞分析、染色體核型分析等方面，藉助於顯微分光光度技術，還可定量測試細胞內DNA，RNA含量和分布，隨著圖像分析處理技術的進展，圖像分析處理的方法也由靜態到動態，由平面到三維立體，由單色到真彩色而不斷進展，它在生物醫學應用領域中的作用將越來越重要。
圖像分析處理通常是指計算機數字圖像處理(image processing，IP) ，為了便於用計算機處理，必須把圖像作為二進位數值來表示。普通光學系統和電視攝像等成像設備得到的是模擬圖像，圖像在二維平面上位置和強度的分布是連續的，要得到數字圖像，必須對模擬圖像進行空間點陣上的抽樣和顏色灰度的量化的數位化操作，得到以像素為基本單位的數字矩陣，每個像素的顏色由灰度值表示，通常量化成8比特(bit)，即256個灰度等級。所謂數字圖像就是灰度值的二維數組圖像，如用函數F(x，y)表示數字圖象，F(i，j)除了代表圖像中位於i，j處的像素的同時，還表示該像素的灰度值的大小。數字圖像一般採用正多邊形點陣，最常用的是正方形點陣，如圖2-11所示。圖像數位化的精度對圖像質量會有很大的影響，像素越多，圖像解析度越高，灰度等級越高，圖像層次越豐富，清晰度高。數字圖像運算建立在數字矩陣基礎上，有許多基本處理功能和算法形式，與模擬圖像比較具有精度高，通用性強，再現性和靈活性好等優點。
圖2－11 數字圖像示意圖
參照前書圖2-9
圖像分析系統一般由計算機，圖像輸入設備，圖像輸出設備和交互控制設備構成。計算機系統，要求運算速度快，內存大，圖像陣列處理器和顯示卡的內存也應儘可能大，配備大容量存貯器便於圖像備份。圖像輸入設備常用的有高解析度的攝像機、CCD攝像機、掃描儀和數碼像機等。圖像輸出設備有視頻印表機，雷射印表機，圖像硬拷貝機等。交互控制設備有滑鼠和數位化圖形輸入板，可以用人機對話的方式選取工作菜單，執行指令，還可控制圖形的輸入和處理。
圖像分析系統的核心部分是圖像分析處理軟體，分為通用軟體和專用軟體，它直接決定了分析結果的優劣。 醫學圖像成像方式多種多樣，來自不同途徑的圖像不可避免地存在著噪聲和畸變，為了得到較好的圖像分析處理結果，提取我們感興趣的圖像細節，首先必須進行圖像增強(image enhancement) ，在成像過程中 原圖中總存在各種噪聲和畸變，為使像質得到改善以利於特徵提取和圖像識別，對圖像進行預處理，目的是圖像增強也叫圖像質量改善。圖像增強的方法很多，對比度增強可通過灰度變換，直方圖均衡等方式提高圖像的對比度和清晰度。陰影校正和圖像多幀數學運算可消除成像系統形成的照明場誤差，改善圖像的陰影，畸變和明暗差，突出感興趣的圖像特徵。銳化處理通過微分法或梯度法等高頻濾波算法可消除圖像的模糊，增強圖像高頻成分，使圖像輪廓分明。平滑處理常用局部平均法，中值濾波法有效地去除圖像中高頻噪聲。
為了根據圖像的結構特徵，分離出感興趣的對象物，以便進行圖像識別和分析，圖像分割(image segmentation)是選取灰度閾值，區分主要對象、其他對象和背景的主要手段。圖像分割通常用二值化閾值處理，根據圖像的灰度直方圖確定對象物的閾值，使對像物和背景以0和1分別顯示，便於計算機處理，也可進行多相分割，通過灰度直方圖中多個峰值加以區分，分別定出閾值，根據灰度閾值範圍分割出各類對象物。
圖像二值化處理(image binary) 通過各種矩陣算子對二值圖進行腐蝕膨脹，開放封閉，填空洞，擦碎片，骨骼細化等形態學方法處理，也可採用布爾代數方法，進行邏輯運算，從而整理圖像畫面，清除不感興趣的對象，便於計算機最終進行模式識別和特徵提取，這種圖像整理方法是圖像處理不可缺少的步驟。
經圖像分割和二值化處理後的圖像，突出了對象物形態特徵，最後進行圖像識別(image recognition)和圖像分析，通過對圖形特徵的編碼識別和描述，進行特徵提取，然後進行全自動和交互測量分析。圖像分析還可以作圖像重建(image reconstraction)和圖像復原(image restoration)。人眼只能感覺可見光，對可視圖像進行判讀和分析，對那些通過各種傳感器觀測的不可視信息的圖像數位化是圖像重建的一個重要內容，另外利用傅立葉變換等方法對X線斷層掃描圖像進行三維重建復原出體內器官的三維立體圖形等，也是圖像重建的重要內容。圖像復原是利用各類濾波方式消除圖像中噪聲和模糊，改善圖像質量。