分析细胞学技术

分析细胞学是从定量的角度对细胞的各种形态学参数、生物学特征、细胞生化成分的组成及含量以及细胞的各种功能等进行研究，将以往各种细胞学技术从定性、定位进一步发展到定量的研究，获得定量的测量数据，以更客观地揭示生命活动的规律。分析细胞学技术的发展有两个主要领域，固定式细胞分析和流动式细胞分析。固定式细胞分析是指细胞样品固定在载玻片或培养皿上，通过显微镜，由成像系统获取图像，定量分析细胞的形态学参数和细胞内一些生化成分的含量。常用仪器有显微分光光度计、图像分析系统和激光扫描共聚焦显微镜。流动式细胞分析要求将细胞样品悬浮在液体中，这些细胞悬液加入仪器后，高速度地流过仪器的检测区，仪器检测悬液中每一个细胞，并进行分析测定，记录每一个细胞众多的生物学参数，并可根据预选的条件将其中特殊的细胞亚群分选纯化出来，以供进一步的深入研究，这类仪器统称为流式细胞仪。以下对流式细胞分析技术、显微分光光度计和图像分析系统作简要介绍。激光扫描共聚焦显微镜已在显微镜技术一节介绍。

一、流式细胞分析技术

流式细胞仪（flow cytometer，FCM ）从原理上讲是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪，它是结合激光技术、光电测量技术、数字计算机技术和荧光细胞化学技术的产物，是分析细胞学领域的重要仪器。流式细胞术是一种对悬液中单个细胞或细胞器进行高速测量和自动分析的测量技术，每秒能测量数万个细胞并多参数检测，还能在分析的同时分选出有指定特征的细胞。

（一）流式细胞仪的结构与原理

流式细胞仪的一般结构可分为三个部分，细胞流动室和液流驱动系统；激发光源及其光束成形系统；细胞信号检测和分析系统（图2－10）。这三部分在仪器中一般按三个互为垂直的轴线安置，即X轴方向的激发光轴线、Y轴方向的细胞荧光信号检测轴线和 Z轴方向的细胞流轴线。此三个轴线的交点即为仪器的细胞信号检测区。样品中的每一个细胞必须按顺序依次以相同的速度和轨迹通过此检测区。每一细胞沿Z轴流经检测区时，受到激发光照射。细胞受光照时产生细胞的散射光信号与荧光信号，这些细胞信号由检测器收集，经计算机软件分析处理，这就是流式细胞分析。

流动室是流式细胞仪的核心部件，它采用液体动力学分层鞘流技术，层流技术保证样品中的每一细胞都沿流动室的中心轴运动，实现了每一细胞以相同的速度、相同方向、相同的轨迹逐个依次通过检测区，流动室也可称为单细胞流发生器。激光是一种单色性、方向性、相干性好的高强度光源，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。流式细胞仪的激发光源通常采用有多条可调谐的输出谱线的氩离子气体激光器，它能与多种荧光染料激发谱匹配。在实际应用时，一般采用单谱线488波长作为激发光源。检测器采用多通道光电倍增管，由数字显示器和示波器实时显示各种信号波形及数据参数，结果由计算机分析处理。

图2-10 FCM工作原理图 参照前书图2-8

流式细胞仪分选装置一般由超声振动器、液滴充电电路、静电高压偏转场等组成。细胞分选是在细胞分析的基础上进行的，经确认需要分选的细胞，在该细胞到达液流断离端的即刻，由液滴充电电路发出一个充电脉冲，保证该包含有要分选细胞的液滴断离后带有静电荷。带电液滴向下运动经过高压偏转电场时，在静电力的作用下偏离原运动轨迹。带正电荷的液滴偏向负极，带负电荷的液滴偏向正极。静电高压值一般是固定的，调节充电脉冲幅度，改变液滴荷电多少，可改变充电液滴的偏转角和偏转距离。分选所得的细胞可以用玻片、试管、96孔板等进行收集,结合分选后的细胞培养、细胞形态学观察、细胞图像分析等结果，可以综合单个细胞的更多信息，这是其他细胞学技术难以实现的。

流式细胞仪中被测样品的细胞，流经仪器检测区时受到激发光的照射，激发光与细胞相互作用后可产生散射光信号和荧光信号。散射光信号是指激发光与细胞相遇作用后反射、折射、衍射等综合的结果，它能反映细胞群体及其不同亚群形态学的一些信息，并且不依赖细胞样品的荧光染色过程。荧光信号主要是指经过特异荧光染色后细胞受照发射的荧光信号。各种特异荧光染色方法是针对细胞内各种不同的生化成分或各种特异抗原等设计的。每一种荧光染色方法中必须用到一种或多种的荧光染料。由于每一种荧光分子结构不同，考虑荧光激发谱与荧光发射谱的接受时，通常要注意选择合适的激发光源和各类分束滤色片。流式细胞术为了保证获得准确的测试分析结果必须进行必要的质量控制，选用标准荧光微球和固定的鸡血细胞是最常用的仪器参考标准。

（二）流式细胞术样品制备

流式细胞术要做高精度的单细胞定量分析，对细胞样品的制备技术有着特殊的要求。一般包括单细胞悬液的制备和细胞荧光染色。

1．单细胞悬液的制备

流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上，制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。对不同来源和不同形式的样品，根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。

（1） 单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品，标本经过简单的制备悬液，离心分离处理，就可以得到分散较好的单个细胞悬液，是理想的流式细胞术检测对象。

（2） 对于不同组织来源的实体组织标本，采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。

（3） 石腊包埋组织单细胞悬液的制备，可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液，去除碎片的单细胞悬液用70%酒精固定保存。

流式细胞术所测的细胞样品要求细胞呈单个分散状态，其中细胞团块，细胞碎片尽可能少，分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证下一步的荧光染色处理。所以在实际应用时，一个理想的单个细胞分散的细胞悬液样品的制备往往是两种或多种方法的结合使用，才能获得理想的细胞悬液。

2. 细胞的荧光染色

流式细胞术快速分析单细胞的各种生物学特性和各种生化成份并定量测定这些参数是通过荧光细胞化学方法实现的。与光镜下或电镜下的细胞化学方法一样，对细胞内的每一种生化成份都可以找到其特异的荧光细胞化学染色方法。由于流式细胞术所需求的荧光细胞化学过程必须在细胞悬液中进行，因而又有其特点。细胞荧光染色必须选择适当的荧光探针。荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成份是否为特异性结合，严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。染料的荧光光谱和量子产率是受环境因素影响的，在相同的条件下，荧光反应产物的产率（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系，因此足够的特异性和可靠的定量关系是荧光细胞化学过程的两个基本评价标准。

现在荧光探针已有几千种，正确选择荧光探针是首要工作。常用荧光探针有细胞活性探针，有活细胞荧光探针和死细胞探针之分；膜荧光探针主要用于生物膜以及脂质转运和代谢动力学研究，较多地用于膜融合和脂质转移的观察；离子膜探针有阴离子型膜探针，大多数探针荧光基团标记在脂肪酸的烷基上，阳离子型膜探针较易定位在胞膜，可检测膜表面积和细胞体积的改变，中性膜探针包括非极性和两性探针，有可能对膜有特异的亲和力；细胞器探针能够渗透到细胞内，选择性地与细胞中的细胞器结合的荧光物质，实质上就是荧光染料；位点特异性探针是指可选择性地与生物大分子相结合或进入细胞内与某些特异位点相结合，来研究细胞内外结构及其活性的探针；胞内离子探针利用荧光检测细胞内各类离子浓度，包括Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、和H⁺ 等，其它还有可溶性荧光探针、核酸荧光探针、电位敏感性荧光探针、底物荧光探针和笼锁化合物荧光探针等。

目前，流式细胞术广泛应用于细胞含量测定、核型分析、细胞凋亡检测、细胞免疫表型分析、细胞因子检测和细胞分选等方面，应用范围在不断地扩大。

二、显微分光光度术

显微分光光度术（microspectrophotometry， MSP）实质上是显微镜技术和分光光度技术的结合。它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测量基础，可以对细胞内的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试，是组织化学和细胞生物学中定量研究的必不可少的工具。

显微分光光度计由主控计算机、多功能显微镜、透射和落射光源、单色仪、高精度扫描台和光电倍增管等构成。常用测量方法有显微荧光光度术（Microfluorometry）、显微密度术（Microdensitometry）、细胞光度术（Cytophotometry）显微反射光度测量及波长扫描测量等。与通常的生化定量方法相比，用显微光度术测定物质含量的主要优点是所用材料少，在同一涂片上测得多个参数；结合形态学特点，可选择测定单个细胞或细胞器内的多种物质及细胞的代谢产物，同时可将测量光栏定位于细胞的某一部位或细胞器中；整个测量不需复杂的纯化过程，能在短时内测得结果，便于观察药物作用对细胞活性改变的影响

显微吸收光度术测量

显微吸收光度法时一种光度测量的化学方法，它基于细胞内的蛋白质、多糖、核酸、脂类和酶染颗粒能在不同等电点下电离出不同侧基，因而造成对染料亲和力不同，应用不同的化学试剂染色，可使不同的细胞组分染上不同的颜色，在显微镜下成为可见的结构。染料于组分的结合必须是特异性的，即染料、细胞组分结合物的光吸收是遵循朗伯-比尔定律，而且染色深浅与被染细胞组分之间呈化学剂量学关系，符合这两者关系的样本就可应用吸收测量法，通过光检测器（可使光能变成电能）测量有色化合物吸收单色光的量。

当光束通过固体液体或气体介质时，常有部分光被吸收转换成其他形式的能量。物质的光吸收和光波长有关，其吸收能力可通过测定入射光经测量区域的前后光强度换算出光密度来定量分析，它的吸收特性必须遵循朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律。

朗伯-比尔定律规定，当单色的平行光通过均匀溶液时，溶液的吸收能力和溶液的路程长度及溶质浓度成正比。可通过消光度A来确定。

A=-lgT=lgI_o/I=K·C·L

式中T为溶液透光率，I_o和I分别为入射光强和透射光强，K为吸收常数，C为吸光溶质浓度，L为光程。

由于光强度比较容易测量，经单色仪或干涉滤光片能得到单色光，显微镜近轴区的照射光近似于平行光，所以凡在涂片切片中含有吸光特性的物质,理论上均可采用吸收光度法测量。动植物中许多天然有色物质如肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素c等，可用吸收光度法测含量；组织化学法染色的完整细胞的涂片如DNA的福尔根染色，可用该方法测量胞核DNA相对含量；还可用该法进行各类酶标的定量测量，对蛋白质进行干扰校正后在天然吸收基础上测定核酸含量。

显微吸收光度测量需满足朗伯-比尔定律条件，待测物质需为均质，但生物学物质很少是均质的，而且显微镜成像过程中，经过光路系统各界面多次折射反射后会导致测量中的分布误差、闪烁误差、系统误差等，影响测量精度。所以除校正系统至最佳状态外，常用双波长法、一波二区法和扫描法来消除误差。扫描法是最令人满意的方法。测量时，先将待测物分成大量小区域，近似认为每个小区域内物质分布为均质，采用顺序逐点扫描法测出各小区域的消光度，经积分后换算出待测物的总消光度，求得其相对含量。扫描法根据不同扫描方式可分为：飞点扫描、像扫描、物扫描、TV扫描等。在实际测量时，台物扫描是最常用的方法，在高精度扫描台上放好样品，确定其扫描范围和波长，根据放大倍数确定测量光栏的大小，根据待测物确定单色入射光波长，选取全自动扫描后由计算机数据处理并显示结果及扫描图形。台物在x方向和y方向上来回移动，而测量光栏位置不动，使台上的被测物质各小区域依序进入测量光栏内而被测量；也可用影象扫描，台物不动，测量光栏的象在台物上沿x方向和y方向来回移动，扫描测量重复性好，准确性和灵敏度高，测量精度可达10^-9g，可方便地进行细胞内细微结构的分析，区分不同细胞类型的差别。

（二）显微荧光光度测量

定量显微荧光光度测量是组织化学和细胞化学中的另一种重要技术，可通过测试固定组织细胞内的荧光反应物来对生物学标本进行定量分析。荧光种类有物质的自发荧光或是用荧光染料对某些生物学物质作特选染色后产生的继光荧光。

与吸收光度测量相比，显微荧光光度测量有许多明显的优点。一般荧光测量所用染料浓度远比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足够暗时可对低浓度荧光物质高度敏感，可测量细胞内分散的微小颗粒。荧光物质本身是自发光体，无论测量孔径内物体形状规则与否，物质分布均匀与否，物体辐射的光量子在光电倍增管上都产生同样的效应，所以无需扫描测量就可避免分布误差。通过选取适当的激发波长和发射波长的谱线和宽度，可以做到高特异性的测量，通常显微分光光度计选用适当的窄带滤色片来获取所需荧光波长，高精度的显微分光光度计采用光栅单色仪，可获得5nm带宽的激发波长和检测波长。荧光光度荧光测量方法分有堵塞法和扫描光度法，测量多数采用堵塞法，选取足够大的测量光栏对待测物作总体荧光量测定，样品由计算机定位，可快速测量，适于大样本分析。荧光光度测量缺点是：荧光易衰减，有漂白作用，有时会猝灭，还必须减去本底荧光值。因此测量时要提高信噪比，必须掌握适当的激发时间和合适的荧光标准。

三、图像分析系统

图像分析（image analysis，IA）是分析细胞学中主要测量手段之一，常用于细胞形态分析、肿瘤细胞分析、染色体核型分析等方面，借助于显微分光光度技术，还可定量测试细胞内DNA，RNA含量和分布，随着图像分析处理技术的进展，图像分析处理的方法也由静态到动态，由平面到三维立体，由单色到真彩色而不断进展，它在生物医学应用领域中的作用将越来越重要。

图像分析处理通常是指计算机数字图像处理(image processing，IP) ，为了便于用计算机处理，必须把图像作为二进制数值来表示。普通光学系统和电视摄像等成像设备得到的是模拟图像，图像在二维平面上位置和强度的分布是连续的，要得到数字图像，必须对模拟图像进行空间点阵上的抽样和颜色灰度的量化的数字化操作，得到以像素为基本单位的数字矩阵，每个像素的颜色由灰度值表示，通常量化成8比特(bit)，即256个灰度等级。所谓数字图像就是灰度值的二维数组图像，如用函数F(x，y)表示数字图象，F(i，j)除了代表图像中位于i，j处的像素的同时，还表示该像素的灰度值的大小。数字图像一般采用正多边形点阵，最常用的是正方形点阵，如图2-11所示。图像数字化的精度对图像质量会有很大的影响，像素越多，图像分辨率越高，灰度等级越高，图像层次越丰富，清晰度高。数字图像运算建立在数字矩阵基础上，有许多基本处理功能和算法形式，与模拟图像比较具有精度高，通用性强，再现性和灵活性好等优点。

图2－11 数字图像示意图

参照前书图2-9

图像分析系统一般由计算机，图像输入设备，图像输出设备和交互控制设备构成。计算机系统，要求运算速度快，内存大，图像阵列处理器和显示卡的内存也应尽可能大，配备大容量存贮器便于图像备份。图像输入设备常用的有高解像度的摄像机、CCD摄像机、扫描仪和数码像机等。图像输出设备有视频打印机，激光打印机，图像硬拷贝机等。交互控制设备有鼠标和数字化图形输入板，可以用人机对话的方式选取工作菜单，执行指令，还可控制图形的输入和处理。

图像分析系统的核心部分是图像分析处理软件，分为通用软件和专用软件，它直接决定了分析结果的优劣。 医学图像成像方式多种多样，来自不同途径的图像不可避免地存在着噪声和畸变，为了得到较好的图像分析处理结果，提取我们感兴趣的图像细节，首先必须进行图像增强(image enhancement) ，在成像过程中 原图中总存在各种噪声和畸变，为使像质得到改善以利于特征提取和图像识别，对图像进行预处理，目的是图像增强也叫图像质量改善。图像增强的方法很多，对比度增强可通过灰度变换，直方图均衡等方式提高图像的对比度和清晰度。阴影校正和图像多帧数学运算可消除成像系统形成的照明场误差，改善图像的阴影，畸变和明暗差，突出感兴趣的图像特征。锐化处理通过微分法或梯度法等高频滤波算法可消除图像的模糊，增强图像高频成分，使图像轮廓分明。平滑处理常用局部平均法，中值滤波法有效地去除图像中高频噪声。

为了根据图像的结构特征，分离出感兴趣的对象物，以便进行图像识别和分析，图像分割(image segmentation)是选取灰度阈值，区分主要对象、其他对象和背景的主要手段。图像分割通常用二值化阈值处理，根据图像的灰度直方图确定对象物的阈值，使对像物和背景以0和1分别显示，便于计算机处理，也可进行多相分割，通过灰度直方图中多个峰值加以区分，分别定出阈值，根据灰度阈值范围分割出各类对象物。

图像二值化处理(image binary) 通过各种矩阵算子对二值图进行腐蚀膨胀，开放封闭，填空洞，擦碎片，骨骼细化等形态学方法处理，也可采用布尔代数方法，进行逻辑运算，从而整理图像画面，清除不感兴趣的对象，便于计算机最终进行模式识别和特征提取，这种图像整理方法是图像处理不可缺少的步骤。

经图像分割和二值化处理后的图像，突出了对象物形态特征，最后进行图像识别(image recognition)和图像分析，通过对图形特征的编码识别和描述，进行特征提取，然后进行全自动和交互测量分析。图像分析还可以作图像重建(image reconstraction)和图像复原(image restoration)。人眼只能感觉可见光，对可视图像进行判读和分析，对那些通过各种传感器观测的不可视信息的图像数字化是图像重建的一个重要内容，另外利用傅立叶变换等方法对X线断层扫描图像进行三维重建复原出体内器官的三维立体图形等，也是图像重建的重要内容。图像复原是利用各类滤波方式消除图像中噪声和模糊，改善图像质量。