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細胞培養
生物體是一個高度統一的整體，而細胞生物學的主要對象是生物體內的各種細胞，很顯然，在整體條件下研究單個細胞或某一細胞群在體內（in vivo）的功能活動是非常困難的。在實際工作中，人們常常從生物體內取出組織或細胞，在體外(in vitro)模擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養，使之保持一定的結構和功能，以便於我們的觀察研究，這種方法就是細胞培養（cell culture）。有時細胞培養也稱為組織培養（tissue culture），二者可作為同義語使用。
細胞培養的工作始於20世紀初（ Harrison，1907），目前已廣泛應用於生物學、醫學的各個領域。細胞培養主要具有兩個方面的優點，其一是人工培養條件易於改變並能嚴格控制，便於研究各種因素對細胞的結構、功能和各種生命活動規律的影響；其二是細胞在體外培養環境中可以長期存活和傳代，因此可以比較經濟地、大量地提供在同一時期、條件相同、性狀相似的細胞作為實驗樣本。
細胞培養技術也存在著一定局限性，主要是細胞離體以後失去與體內環境的密切聯繫，失去了神經體液的調節和不同細胞間的相互作用，特定分化基因的表達減弱或停止，而進化中保守的細胞生長和增殖活動卻可維持，遂使體內外細胞出現了差異，這是應用細胞培養技術應該注意的問題。
一．細胞培養的基本知識
（一）培養細胞的類型及其特點 體外培養細胞大多培養在瓶皿等容器中，根據它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。
1．貼附型 大多數培養細胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長，這類細胞在體內時各自具有其特殊的形態，但在體外培養時貼附於支持物後形態上表現單一化而失去體內原有的某些特徵，多呈上皮樣或成纖維細胞樣。
正常貼附型細胞具有接觸抑制的特性，細胞相互接觸後可抑制細胞的運動，因此細胞不會相互重疊於其上面生長。細胞生長、匯合成片後，雖發生接觸抑制，但只要營養充分，仍可增殖分裂，但當細胞數量達到一定密度後，由於營養的枯竭和代謝物的影響，細胞分裂停止，稱為密度抑制。腫瘤細胞的接觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細胞可向三維空間發展，導致細胞堆積，並可生長至較高的終末細胞密度。
2．懸浮型 少數細胞在培養時不貼附於支持物上，而以懸浮狀態生長，包括一些取自血、脾或骨髓的培養細胞，尤其是血液白細胞，以及一些腫瘤細胞。細胞懸浮生長時可以呈單個細胞或細小的細胞團，胞體為圓形。其優點是在培養液中生長，生存空間大，允許長時間生長，便於大量繁殖。
（二）培養細胞的增殖過程
1．培養細胞一代的增殖過程 培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存
空間相對孤立，營養是有限的。當細胞增殖至一定密度後，則需分離出一部分細胞接種到其他容器，並及時更新培養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代（passage 或subculture）。從細胞接種到下一次傳代再培養的一段時間叫一代。需要注意的是細胞培養一代與細胞倍增（doubling）的概念是不同的，細胞倍增指的是細胞數增加一倍。一般地，細胞培養一代的過程中，細胞可倍增2-6次。細胞傳一代以後，細胞群體一般要經過潛伏期、指數增長期與平台期三個階段。以貼附型細胞為例說明如下：細胞接種後呈懸浮狀態，在0.5-4 h內貼附於支持物，進入潛伏期，此期細胞無增殖發生，原代細胞持續約24-96 h，而腫瘤細胞或無限傳代細胞僅需6-24 h。隨著分裂相細胞的出現並逐漸增多，細胞群體進入指數增長期，此期又稱對數期，細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適於進行實驗研究；此期時間長短因細胞本身特性及接種密度、血清濃度而不完全相同，一般可持續3-5天。隨著細胞數量的逐漸增多，細胞相互接觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細胞停止分裂繁殖，進入平台期，細胞數目不再增加，但仍維持一定時間的活力，此時應及時分離傳代，否則細胞將因中毒而發生改變甚至死亡。懸浮型細胞一般沒有潛伏期，接種並添加新鮮培養液後即可迅速進入指數增長期。
2．培養細胞的生命期（life span） 培養細胞的生命期指的是細胞在培養中持續增殖
和生長的時間，一般可分為原代培養期、傳代期和衰退期。從體內取出細胞接種培養到第一次傳代叫原代培養，一般持續1-4周。原代細胞一經傳代後便稱為細胞系（cell line），進入傳代期，此期在全生命期中持續時間最長，細胞增殖旺盛，並能維持二倍體的核型。一般情況下可傳代10-50次，隨後細胞增殖緩慢以至完全停止，細胞進入衰退期，最後死亡。腫瘤細胞系可無限增殖而無衰退期，正常細胞系也可在傳代期末期或衰退期發生自發轉化，細胞獲得永生性即永久增殖的能力，稱為無限細胞系或連續細胞系。
3．培養細胞的生存條件 培養細胞需要特定的培養基和培養設備。
（1）培養基 培養細胞所需營養物質與體內細胞相同，包括糖、胺基酸、維生素、無機離子、微量元素等。細胞在體外生存於含各種營養成分的培養基中。培養基的種類很多，按其物質狀態，分半固體培養基（如軟瓊脂培養基）和液體培養基兩類，其中液體培養基（即培養液）使用最為廣泛。用各種合成培養基配製培養液時，尚需加一定量的動物血清（胎牛或小牛血清）。配製時根據添加血清量的多少，構成作用不同的培養液，用於不同細胞和不同研究目的。一般情況下需添加10～20％的血清，以維持細胞較快的生長增殖速度，稱為生長培養液；為維持細胞緩慢生長或不死，加2～5％血清含量即可，稱為維持培養液。此外為防止污染，培養液中尚需加一定量的抗生素（多用青黴素100單位/ml和鏈黴素100μg/ml）。
（2） 細胞培養設備 培養細胞在培養器皿中生長，浸浴於培養液，並需要特有的環境，包括一定的溫度、濕度和氣體成分。培養器皿主要有碟和瓶兩類，材質為玻璃或塑料，現在使用一次性的塑料培養器皿日益普及。培養環境通常由CO2恆溫孵育箱提供，恆定地提供37C溫度、95％濕度和一定量的CO2（通常為5%），CO2可使培養液維持穩定的pH。
另外，細胞培養過程中進行換液、傳代等工作時需在無菌工作檯上進行。
二．細胞培養的基本技術
（一）細胞分離和原代培養
原代培養也叫初代培養，指從供體取得組織，分離得到所需細胞後接種於培養瓶，進行首次培養。
培養材料為血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液時，可採用低速離心法分離。培養材料為組織塊時，首先要把組織塊剪切至儘量小，然後用胰蛋白酶或膠原酶消化法使組織進一步分散，以獲得細胞懸液。
（二）培養細胞的傳代
細胞由原培養瓶內分離稀釋後傳到新的培養瓶的過程稱之為傳代；進行一次分離培養稱之為傳一代。 培養細胞傳代根據不同細胞採取不同的方法。
貼壁細胞的消化傳代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）的消化液消化傳代。EDTA能從組織生存環境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。消化液使細胞脫落形成細胞懸液，然後以合適比例接種在新的培養瓶內。
懸浮細胞的傳代可直接添加新鮮培養液，或離心收集後換新鮮培養液，以一定比例稀釋傳代。
（三）細胞的凍存和復甦
培養細胞在傳代中性質易發生改變, 有支原體污染的危險。研究工作也要求細胞株的代數應維持在一定期限內。解決這些困難的方法就是將細胞凍存，需要的時候再行復甦。凍存前需向培養基中加入保護劑甘油或二甲基亞碸（DMSO），以減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存與復甦的原則是「慢凍快融」。細胞凍存在液氮中，從理論上講貯存時間是無限的。
（四） 細胞培養微生物污染的檢測
細胞培養過程中操作不當時，易引發微生物污染，主要污染微生物為黴菌、細菌和支原體。可用多種手段明確污染性質，從而從源頭上杜絕污染。然而微生物污染一旦發生，多數無法救治。為了防止污染的蔓延，應及時丟棄污染細胞。
