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细胞培养
生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（in vivo）的功能活动是非常困难的。在实际工作中，人们常常从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们的观察研究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。
细胞培养的工作始于20世纪初（ Harrison，1907），目前已广泛应用于生物学、医学的各个领域。细胞培养主要具有两个方面的优点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，因此可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。
细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。
一．细胞培养的基本知识
（一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。
1．贴附型 大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。
正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。
2．悬浮型 少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。
（二）培养细胞的增殖过程
1．培养细胞一代的增殖过程 培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存
空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage 或subculture）。从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在0.5-4 h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h。随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长期。
2．培养细胞的生命期（life span） 培养细胞的生命期指的是细胞在培养中持续增殖
和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。原代细胞一经传代后便称为细胞系（cell line），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。
3．培养细胞的生存条件 培养细胞需要特定的培养基和培养设备。
（1）培养基 培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。培养基的种类很多，按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。用各种合成培养基配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加10～20％的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，加2～5％血清含量即可，称为维持培养液。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素100μg/ml）。
（2） 细胞培养设备 培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。培养器皿主要有碟和瓶两类，材质为玻璃或塑料，现在使用一次性的塑料培养器皿日益普及。培养环境通常由CO2恒温孵育箱提供，恒定地提供37C温度、95％湿度和一定量的CO2（通常为5%），CO2可使培养液维持稳定的pH。
另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行。
二．细胞培养的基本技术
（一）细胞分离和原代培养
原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。
培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用低速离心法分离。培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用胰蛋白酶或胶原酶消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液。
（二）培养细胞的传代
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。
贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养瓶内。
悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，以一定比例稀释传代。
（三）细胞的冻存和复苏
培养细胞在传代中性质易发生改变, 有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。冻存前需向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），以减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的。
（四） 细胞培养微生物污染的检测
细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染，主要污染微生物为霉菌、细菌和支原体。可用多种手段明确污染性质，从而从源头上杜绝污染。然而微生物污染一旦发生，多数无法救治。为了防止污染的蔓延，应及时丢弃污染细胞。
