培养细胞的保存和复苏

做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。

1. 影响冻存细胞活性的因素
   1. 细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。
   2. 细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。
   3. 保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。
   4. 复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃～43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。
2. 冻存与复苏方法

适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。A.细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2～5X106/ml。B.分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。C.冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。D.为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃～43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。E.细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。