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显微镜技术
显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（light microscope）、电子显微镜(electron microscope )和扫描探针显微镜(scanning probe microscope)三个层次的显微镜和相应的技术。在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopic structure）。随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。
- 显微镜与分辨率
人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。17世纪英国人Hooke和荷兰人 Leeuwenhoek分别利用原始的光学显微镜发现了机体的细胞以及许多微生物，观察到了它们的微细结构，使生物学进入了光学显微镜时代，开创了组织细胞学的微观世界研究。但是不管多么完善的光学显微镜，它的分辨率极限为0.2µm，也就是说不能分辨出距离小于0.2µm的两个点。20世纪30年代，德国的Ruska发明了电子显微镜，突破了光镜的局限，其分辨率可达2nm左右，使人们对于细胞结构认识逐步深入到超微观世界。20世纪80年代IBM苏黎世实验室的Binning等人发明了扫描隧道显微镜，分辨率达0.2nm 左右，可直接观察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等结构。
分辨率（resolution）是指区分开两个质点间的最小距离。对于任何显微镜来说, 分辨率都是最重要的性能参数。
光学显微镜的分辨率与光波波长，物镜数值孔径有关，可用Abbe公式表示：
0.61λ
d = n × sin
d为分辨率，ｎ为物镜与物体间介质折射率,空气为1，油为1.5，θ为光束进入物镜的半角，sinθ小于１(以极值1代入公式)。
代入公式：
d = 0.61×0.5µm／1.5＝0.2µm
因此在光学显微镜中，λ越短，分辨率越高；n和θ越大，分辨率也越高。n × sinθ简称N.A，即表示数值孔径，物镜上一般都标有 N.A值，N.A值越大，分辨率越高。
从上述计算中我们可以看出，光学显微镜分辨率受到光波波长的限制，大约等于所用光源的半波长。这是由于光波具有衍射现象，当光波波长大于物体二倍时，光波能绕过物体前进，就像没有遇到物体一样，所以在光镜下看不清直径小于波长一半的物体。当物体直径小于200nm（0.2µm）就分辨不清。
电子显微镜采用波长短的电子射线作为照明源，电子射线的波长约为可见光波长的十万分之一，约等于0.0053nm，但由于电子透镜相差的存在，限制了电镜的分辨率，使之不能达到如此高的程度。目前电镜的极限分辨率为0.2nm左右，比光学显微镜极限分辨率提高了约1000倍，比人眼分辨率提高了100万倍左右。
扫描探针显微镜的制作原理与光镜和电镜完全不同，如扫描隧道显微镜是利用量子力学中的隧道效应原理制作成的，是目前分辨率最高的一类显微镜。其侧向分辨率达0.1～0.2nm；纵向分辨率达0.01nm。
- 光学显微镜技术
光学显微镜技术是研究细胞结构最重要的工具，在细胞生物学领域中应用最为广
泛。近年来，随着多种现代生物学技术与光镜技术的结合，使光学显微镜展示出更新的活力。目前光学显微镜已发展成多种类型，用于各类不同的研究目的。在细胞生物学中常用的有普通光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、相差显微镜，以及暗视野显微镜和微分干涉差显微镜。
（一）普通光学显微镜技术
普通光学显微镜（简称光镜）是最常使用的显微镜，主要由三部分组成：聚光镜、物镜和目镜。光镜采用可见光作光源，分辨率为0.2µm，放大倍率为1000倍，其他几种显微镜都是在此基础上发展起来的。
用于普通光学显微镜观察的生物样品必须应过一系列的组织处理并制成1～10µm的切片。常规的样品制备方法是：甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片，苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）染色，光镜观察。
普通光学显微镜能观察染色的生物标本的结构，主要是因为光线通过染色标本时其颜色（光波的波长）和亮度（光波的振幅）发生变化，人的眼睛才能观察到。
（二）荧光显微镜技术
荧光显微镜（fluorescent microscope）是以各种特定波长光源激发生物标本中的荧光物质，产生各种可见颜色荧光的一种显微镜。荧光显微镜一般采用高压汞灯和弧光灯作为光源，在光源和反光镜之间放一组滤色片以产生特定波长的激发光，光谱一般从紫外到红外，从而激发各种荧光物质产生不同波长的发射光。利用荧光显微镜可研究荧光物质在组织和细胞内的分布，以达到对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察的目的。与生物学有关的荧光现象有三种：
⑴ 自发荧光 通过激发光会使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A等。
⑵ 诱发荧光 通过诱导剂作用而发的荧光，如甲醛蒸气处理可诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光。
⑶ 荧光染料染色荧光 例如吖啶橙可以对细胞DNA、RNA同时染色，显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。荧光染料可和抗体共价键结合，这种标记的抗体再和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光进行抗原定位。
由于荧光显微镜技术染色简便、敏感度高而且图像色彩鲜明，所以是目前对特异蛋白质等生物大分子定性、定位的有力的工具。
(三)相差显微镜技术
相差显微镜（phase contrast microscope）是一种可以观察活细胞或未经染色的标本的显微镜。相差显微镜能够改变直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。因此可以观察活细胞或未经染色的标本。
相差显微镜与普通显微镜的主要区别是在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，所以又使两组光线之间增加了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗区别。
观察活体细胞常采用倒置相差显微镜，它与一般相差显微镜的不同是光源和聚光器装在上方，相差物镜装在载物台下方，便于观察在培养瓶中贴壁培养的细胞，这样可清楚地分辨细胞的形态、细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。
（四）微分干涉差显微镜技术
微分干涉差显微镜(differential interference contrast ) 又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
微分干涉差显微镜利用的是偏振光，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品反差并且具有很强的立体感。
微分干涉显微镜能使细胞核及较大的细胞器如线粒体等具有较强的立体感，比较适合于显微操作。目前多用于基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作。将微分干涉差显微镜接上录象机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。
（五）激光扫描共焦显微镜
激光扫描共焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)，也被称为激光扫描细胞仪(laser scanning cytometer，LSC)。自20世纪70年代问世以来很快得到迅速发展，成为分子细胞生物学的新一代研究工具。激光扫描共焦显微镜在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统，整套仪器均由计算机自动控制，专用软件监控和执行各组件之间的切换。生物医学应用中LSCM的显微镜以倒置显微镜为主，便于活细胞检测。与普通光镜和荧光显微镜相比有一些明显的优点，其中主要有：
（1）普通显微镜使用的光源为卤素灯，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均
会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量。LSCM的光源为激光，是单色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，纵向分辨率高，可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量。
（2）普通荧光显微镜分辨率低，显示的图象结构为多层面的图象迭加，结构不够
清晰。LSCM结构上采用双针孔(pinhole)装置，形成物象共扼的独特设计(如图2－2所示)。激光通过聚光镜焦平面上针孔形成点光源经物镜在焦平面上对样品进行逐点扫描，样品上每个照射点，反射后经过物镜折射到像焦平面的探测针孔处成像，经空间滤波后，有效地抑制同焦平面上非测量光点形成的杂散荧光和样品的不同焦平面发射来的干扰荧光。每个像点被光电倍增管(PMT)或冷电感藕合器件(cCCD)探测器接收。因为光学系统物象共扼，只有物镜焦平面上的点经针孔空间滤波才能形成光点图象，扫描后可得到信噪比极高的光学横断面，分辨率比普通光学显微镜提高1.4倍。LSCM能以0.1um的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体结构，这种功能被形象地称为"显微CT"。
（3）LSCM的高灵敏度、高分辨率和高放大倍数，减少了光淬灭的影响，提供了
普通光学显微镜无法显示的结构信息，并适用于达到毫秒级的快速变化检测。
LSCM最常用的功能是荧光检测、三维重建和显微操作等。其中荧光检测覆盖的内容极为广泛，通过多种荧光探针或荧光连接抗体，可对细胞内离子、pH值、各种蛋白质分子进行动态测定。另外利用激光扫描还可以对细胞进行特殊操作，例如光刀切割法(cookie-cutter) 作粘附细胞分选(adhered cell sorting)，能杀灭不需要的细胞，保留所选细胞亚群继续培养；激光光陷阱技术（又称为光镊技术）对目标细胞进行非接触式的捕获和固定，并进行精确操作；激光作为光子刀可以用来完成细胞膜瞬间打孔以及对线粒体、溶酶体、染色体和神经元突起的切割等显微细胞外科手术。
三、电子显微镜技术
电子显微镜技术简称电镜技术，它包括电子显微镜(electron microscope )和样品制备技术（techniques of sample preparation）两大方面。电子显微镜的基本原理与光学显微镜相同（图2—3），但光源和透镜有所不同，电镜利用电子束作光源，电磁场做透镜，因而最佳分辨率可达1-2 Å，放大倍率达150万倍。样品制备技术是制作电镜标本的综合技术，比光学显微镜制片过程更精细和复杂。它包括普通样品制备技术（如超薄切片技术）和特殊样品制备技术（如电镜酶细胞化学技术）。
第一台电镜诞生于1931年，至今已有70余年的历史，经过不断的改进和提高已从最初的一种电镜发展为多种电镜，分辨率可达到1Å。近年来，随着电镜计算机的一体化，使新型电镜的操作更为简便，图像获取更快捷，而且电镜图像在观察过程中可以得到即时储存和统计分析等，大大提高了电镜的使用效率。
电子显微镜技术是研究细胞超微结构最重要的手段。广泛应用于医学生物学等各个学科，在现代医学科学研究和临床疾病的诊断中发挥着重要的作用。
（一）电子显微镜的种类
电子显微镜是以电子束作光源、电磁场作透镜、具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜通过收集、整理和分析电子与样品相互作用产生的各种信息而获得物体的形貌和结构等。电镜的类型也是利用电子信号的不同和成像的不同而进行分类。主要分为透射电子显微电镜、扫描电子显微电镜、分析电子显微镜和高压电子显微镜。
- 透射电子显微电镜
透射电子显微电镜（transmmision electron microscope），是发展最早、应用最广泛的电镜，一般所说的电镜指的便是透射电镜。透射电镜主要用于观察组织细胞的内部结构。
透射电镜由三大系统组成，包括镜体系统、真空系统和电子线路系统。镜体系统是电镜的主体，结构相当复杂，又分为照明系统、成像系统和观察记录系统。
照明系统由电子枪和聚光镜组成，电子枪发射电子作为电镜的照明光源。在电镜中电子射线在几万伏的加速电压作用下产生了短波长高能电子束，加速电压越高，电子束的波长越短，电镜的分辨率就越高。聚光镜则将来自电子枪的电子束会聚在样品上并可调节照明强度等。
成像系统由样品室、物镜、中间镜和投影镜组成，是电镜具有高放大倍率和高分辨率的关键部位，主要是借助改变各个透镜的电流来获得不同的放大倍率。成像系统的总放大倍率是物镜、中间镜和投影镜放大倍数的乘积。
观察记录系统包括观察室和底片室。观察室内有一个荧光屏，电子束穿透样品，带有样品信息的电子经成像系统放大投影到观察室的荧光屏上，激发荧光屏发出可见光，透过的电子多荧光屏亮，反之则暗，荧光屏的亮、暗程度与样品微细结构一一对应，最终产生具有一定反差的影象。图像的保留可通过荧光屏下的底片室内的胶片感光，使图像拍摄下来，也可将图片通过探头输送到计算机中经打印机打出图片。
电镜有复杂的真空系统和电路系统以维持镜筒的高真空状态和稳定的工作条件。
- 扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（scanning electron microscope）简称扫描电镜。扫描电镜利用二次电子信号成像，用于观察样品表面形貌，图像具有立体感。
扫描电镜的光源部分与透射电镜相同，是由电子枪产生电子射线经聚光镜聚焦形
成一束极细的光斑称为电子探针（electron probe）。电子探针受扫描发生器控制，在样品表面进行逐点扫描，把样品表面的原子外层的电子击出，形成二次电子，二次电子被二次电子检测器收集、转换、放大、转换到显象管，由于显象管的荧光屏上的画面与样品被电子束照射面呈严格同步扫描，逐点逐行一一对应，这样就能看出样品表面形貌。
二次电子发射越多的地方，在像上相应的点就越亮，反之则暗。由于二次电子产生的多少与电子束入射角度有关，也就是与样品表面的起伏有关，所以荧光屏上得到的图像反应了样品表面的立体形貌。
- 分析电子显微镜
分析电子显微镜（analytic electron microscope）简称分析电镜，是一种带有特殊附件波谱仪（length disapersive spectroscope）或能谱仪（energy disapersive spectroscope）的电子显微镜。它可以装配在透射电镜上，也可以装配在扫描电镜上。当高速运动的电子会聚成电子束（探针）打到样品上时，所激发出来的X射线波长是和样品内所含元素的原子序数密切相关的。把特征性X射线根据其波长和强度分别加以收集便可推知样品内包含哪些成分及各元素的含量。
利用分析电镜可以在观察样品形貌的同时了解微小区域（如某一细微结构）内所含元素的种类及其含量，在细胞超微结构水平上对其内部的化学元素成分进行定位、定性、定量分析。从而获知结构变化与其组成的元素变化的关系，它的分辨率很高，元素周期表上大部分元素都能分辨出来。
- 高压电子显微镜
高压电子显微镜（high voltage electron microscope）指加速电压在120KV以上的透射电子显微镜，若加束电压在500KV以上称为超高压电镜。目前世界上超高压电镜最高的加速电压可达3000 KV。
高压电子显微镜的主要特点是分辨本领高，对样品的穿透能力强，可用于观察较厚的样品，整体培养的细胞不需超薄切片即可观察内部的三维微细结构，如微丝、微管等，在偏振镜下可呈现三维排列的图象特点。但电镜体积庞大，价格昂贵，难以普及。
（二）电镜样品制备技术
电镜样品制备技术较复杂，种类也较多，分为普通样品制备技术和特殊样品制备技术。这里简单介绍几种常用的样品制备技术。
- 超薄切片技术
超薄切片技术（ultramicrotomy）是透射电镜样品制备方法中最基本的一种。由于电子束穿透能力的限制透射电镜观察的样品必须很薄，普通光镜切片厚度约3～5µm，而透射电镜切片厚度则要求在50～80nm左右。这种薄切片称为超薄切片。超薄切片技术包括：取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色。
电镜样品采用戊二醛和锇酸双重固定，用酒精或丙酮脱水，环氧树脂进行包埋，
超薄切片机切片，采用重金属如铀和铅进行染色以增加细胞结构间的反差。
- 负染色技术
负染色技术（nagtive stain technique）又称阴性染色，是透射电镜样品制备技术中的一种。此技术是指通过重金属盐在样品四周堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小。常用的重金属有磷钨酸钠、醋酸铀等。
负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作。负染色样品不需经过固定、脱水包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样品匀浆悬浮液进行染色。
- 冷冻蚀刻技术
冷冻蚀刻技术（ freeze-etching technique）又称冷冻复型，是透射电镜样品制备技术的一种，是将样品经快速冷冻→断裂→升华→喷铂→喷碳而最终形成一层印有生物样品断裂面立体结构的复型膜，然后将生物样品腐蚀掉，用铜网将复型膜捞起进行透射电镜观察。
冷冻蚀刻技术能保持细胞原来的结构，立体感鲜明，主要用于生物膜的研究。
- 扫描电镜样品制备技术
扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括观察面的暴露、固定、脱水、干燥和导电等。
样品制备采用戊二醛和锇酸双重固定；乙醇或丙酮脱水。干燥是扫描电镜样品较
重要的步骤。由于生物样品柔软多水，大多数的组织含水量在80%以上，采用自然干燥，会受表面张力影响使细胞表面收缩，形态改变。所以多采用液体CO2临界点干燥法，在临界状态时表面张力系数为零，也就是分子的内聚力等于零时干燥，细胞不再收缩，保持了原有的形态。由于干燥样品不导电，因而需要在样品表面镀一层薄薄的金属膜使样品导电并增加图像的反差和立体感。
四 、扫描探针显微镜技术
扫描探针显微镜（scanning probe microscope, SPM）是二十世纪八十年代发展起来的一类新型的显微镜，它们都是基于近场扫描原理，利用带有超细针尖的探针在样品表面扫描，获得样品的微观信息如表面形貌、电特性、磁特性和柔韧性等，具有原子尺度的高分辨本领，其侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm。扫描探针显微镜有很多种，主要包括扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope, STM）和原子力显微镜（atomic force microscope, AFM）等。
（一）扫描隧道显微镜
扫描隧道显微镜是扫描探针显微镜家族中的第一个成员，是由 G Binnig 和H Rohrer在1981年发明的，他们因此而获得诺贝尔物理学奖。STM的主要原理是利用量子力学中的隧道贯穿效应，其核心部件是一个能在样品表面进行扫描、与样品之间保持一定偏压、其直径为原子尺度的探针（图2-4）。在通常的低电压下，分离的针尖与样品之间（相当于两个电极）具有很大的阻抗，阻止电流通过，称为势叠。当针尖与样品非常靠近时，其间的势叠变得很薄，电子云相互重迭，在针尖与样品之间施加一电压，电子就可以通过隧道效应由针尖转移到样品或从样品转移到针尖，形成隧道电流。通过记录隧道电流的变化就可以获得样品表面的微观信息。STM要求样品表面与针尖具有导电性。
STM有两种成像模式：恒流模式和恒高模式。在恒流模式中，STM通过反馈系统不断调节针尖与样品表面每个检测点上的距离，使隧道电流保持一个不变的恒值，测定扫描头上针尖与样品表面的高度变化就可获得样品表面形貌等微观信息。在恒高模式中，针尖始终保持在样品上方一个恒定的高度上，隧道电流随着样品表面形貌等微观特性的改变而变化，通过检测每个测量点上的电流变化来获得样品表面微观信息。在恒高模式中，扫描头不需要上下移动，从而加快了扫描速度。
（二）原子力显微镜
原子力显微镜是1986年设计完成的，它主要通过检测针尖与样品之间的原子间作用力来获得样品表面的微观信息，因此不要求样品具有导电性。AFM的工作原理是将一个对微弱力非常敏感的微悬臂一端固定，另一端装上探针，针尖与样品表面轻轻接触，针尖尖端原子与样品表面原子间极微弱的排斥力使微悬臂向上弯曲（图2-5）。通过检测微悬臂背面反射出的激光光点在光学检测器上的位置变化，可以转换成力的变化，因为反射光点的位置变化或微悬臂弯曲变化与力的变化成正比。微悬臂的弯曲是多种力的共同作用结果，其中最普遍的是范得瓦尔力，针尖与样品表面微小的距离变化就能产生不同大小的范得瓦尔力。通过控制针尖在扫描中这种力的恒定，测量针尖纵向的位移量，就可获得样品表面的微观信息。
AFM也有两种工作模式：恒力模式和恒高模式。在恒力模式中，通过精确控制扫描头随样品表面形貌变化在纵向上下移动，微持微悬臂所受作用力的恒定，从扫描头的纵向移动值得出样品表面的形貌像。在恒高模式中，扫描头高度固定不变，从微悬臂在空间的偏转信息中直接获取样品表面信息。
SPM具有分辨本领高、可连续动态地在各种环境中（真空、气体和液体）检测物体微观信息等特点，很快被应用于生命科学研究。SPM最早应用于研究生物大分子（DNA和蛋白质等）的结构与功能，这方面已积累了丰富的资料。近年来，在其他方面也展开了积极的才探索，如将AFM用于研究生物大分子之间的相互作用、研究生物结构的纳米操作、研究活细胞的结构与功能以及用于医学和药物学研究等。
文档下载： File:高級光學顯微鏡原理.pdf