细胞周期的测定

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间，即从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束所经历的时间，它反应了细胞增殖速度。测定群体细胞周期的方法很多，主要有同位素标记法、细胞计数法、流式细胞仪测定等。这里主要介绍利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可代替胸腺嘧啶核苷掺入到所复制的DNA新链中，经过一轮复制，在每条染色单体的一条DNA链均含有BrdU，但经染色后染色体却仍为深染。经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占总数的l/2，反映在中期染色体上表现为其中的一条单体浅染。但若经历了三个周期，则约一半的染色体的两条单体均浅染，另一半为一深一浅。这样，通过统计分裂相中各期的比例，就可算出细胞周期的值。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、移液管、离心机、离心管、30W紫外灯、水浴锅、饭盒、擦镜纸、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640细胞培养基（添加有10％ FBS）、Hanks液、BrdU（1.0mg/ml）溶液，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液等。
（二）操作步骤
1．取对数期生长的细胞经消化、洗涤后以一定密度种植在培养瓶或培养板中。
2．细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。
3．培养44～54h加入秋水仙素，终浓度为0.1μg/ml。
4．继续培养4～6h后，常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
5．按照常规染色体制备方法制片。
6．染色体玻片（有细胞一面向下）放在一饭盒中的玻璃支架上，加入2×SSC 液以不超过标本表面为宜，然后在标本上覆盖一张擦镜纸，使纸的两边浸入2×SSC 液中，以保持标本的湿润。
7．将饭盒放在56℃水浴锅中，湿育，上面用30w的紫外灯管6-10cm垂直照射30min。
8．弃去2×SSC液和擦镜纸，立即用4℃左右的流水冲洗。
9．Giemsa液染色5-10min，流水冲洗，干燥后镜检。
10．镜检100个分裂相，统计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
11．根据下式计算细胞周期
细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（h）
（三）注意事项
1．秋水仙素的加入时机会因细胞的类型、生长速度有所差异。
2．加入BrdU后应避光培养。
（四）附录
1．BrdU的配制： 称取BrdU 10mg，无菌条件下溶于灭菌生理盐水中，定容10ml，4℃下避光保存，宜现用现配。
2．2×SSC溶液的配制：NaCl 1.75g，柠檬酸三钠·2H2O 0.885g，加水至100ml，4℃保存。