细胞活力测定

（一）台盼兰染色测定细胞活力
死细胞和受损细胞的细胞膜通常因缺损而不完整，这样某些染料分子便可穿过细胞膜进入到细胞内部并使细胞被染上相应的颜色。与死细胞和受损细胞不同，活细胞的细胞膜结构完整，能阻止染料进入细胞而拒染（dye exclusion）。台盼兰便是这样的染料，经台盼兰染色的死细胞或受损细胞常为浅兰色。除台盼兰外，伊红、苯胺黑也是常用的鉴定细胞活力的染料，所不同的是，经伊红和苯胺黑染色的死细胞或受损细胞分别为红色和黑色。
1．仪器、用品与试剂 血细胞计数板、显微镜、微量加样器、0.4%台盼兰溶液（用PBS溶液配制）。
2．操作步骤
（1）将贴壁细胞用胰蛋白酶消化后再经Hanks液洗涤后制备单细胞悬液，并适当调整细胞密度在106个/ml左右。
（2）取细胞悬液0.5ml加入一小试管中，加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2～3min。。
（3）用微量加样器吸取少量细胞悬液加入到血细胞计数板上的小室中。
（4）显微镜下计数500个细胞，分别数出死细胞和活细胞数目，计算细胞活力。
（5）结果判定：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见其为浅兰色的细胞，活细胞不能被染色，镜下呈无色透明状。
细胞活力（％）＝（总计数细胞数－着色的死细胞数）÷总计数细胞数×100％
3．注意事项
（1）和台盼兰溶液混合后的细胞悬液不可放置时间过长，因为活细胞对染料也有一定摄取能力，若时间太长，活细胞也会被染色。
（2）细胞悬液和台盼兰溶液的用量可根据实验条件及要求进行必要调整。
（3）血细胞计数板用完后要及时用双蒸水、70％酒精认真清洗计数板和盖玻片并用擦镜纸擦干后保存。
（二）MTT法测细胞相对数目和相对活力
四唑盐比色实验是一种常用的检测细胞存活与生长状况的方法，实验所用之显色剂是一种能接受氢原子的染料，化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称MTT。活细胞，特别是增殖期的细胞可通过线粒体代谢过程中产生的的琥珀酸脱氢酶的作用，使外源性淡黄色的四甲基偶氮唑盐（MTT）被还原为蓝紫色的结晶物（formazan）并沉积在细胞中，其形成量与活细胞数呈正相关。利用DMSO或酸化异丙醇进一步溶解细胞中的紫色结晶物formazan，在酶标仪或分光光度计下测定570nm波长处的光吸收值，可间接反映出活细胞数量的变化情况。
1．仪器、用品与试剂 超净工作台、酶标仪、微量加样器、RPMI 1640培养基（添加10％FBS）、96孔细胞培养板、细胞培养箱、恒温摇床、5mg/ml MTT溶液、酸化异丙醇（给异丙醇中加入HCl使最终达0.04 mol/L）或纯的DMSO。
2．操作步骤
（1）接种细胞：取对数期生长的贴壁细胞经消化、洗涤后以一定密度接种在平底96孔板上, 每组设3个平行孔，每孔200μl。
（2）培养细胞：将96孔板移入细胞培养箱，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。
（3）呈色：至收获前4h每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml），继续孵育4h后终止培养，从每孔小心吸弃上清液100μl，再加入DMSO 150μl，置酶联免疫检测仪上振荡10min，以使结晶物充分溶解。
（4）比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。
3．注意事项
（1）设空白对照。空白对照为不加细胞只加培养基，其他步骤与实验组相同，比色时以此孔调零。
（2）依据实验目的、细胞种类、细胞的生长习性选择适当的细胞接种密度和培养时间长短。一般情况下，96孔细胞培养板每孔最多可以生长1×105个细胞，切不可接种密度太高，致使培养终止前细胞过满，影响实验的区分度。
（3）高浓度的血清会导致实验本底增加，应尽量选择不超过10％ FBS的培养条件。
4．附录
5mg/ml MTT溶液的配制：准确称取MTT 0.5克，溶于100 ml的0.01 mol/L pH值7.4的PBS溶液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后，4℃下保存，两周内有效或-20℃冻存。