细胞系基因敲低技术

目前实验室常用的基因敲低技术有三种，分别是shRNA，siRNA和CRISPR/Cas 系统；shRNA和siRNA都是在RNA水平上降低蛋白的表达，CRISPR/Cas是在DNA水平上降低蛋白的表达；shRNA与siRNA的加工方式相同，在细胞核表达后被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致mRNA降解。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，它可以将入侵的噬菌体和外源质粒DNA片段整合到规律成簇的间隔短回文重复序列crisper中，随后被内切酶切割形成crRNA，通过碱基互补配对形成PAM互补区，指导cas9内切酶来对DNA进行定点切割，从而达到在DNA水平上降低蛋白表达的目的。

材料（MATERIALS）

o 试剂（REAGENTS）

慢病毒包装质粒、LB、氨苄青霉素、Amp板子、小抽试剂盒、完全培养基、减血清培

养基（Opti�MEM）、lipo2000、嘌呤霉素、细胞培养皿（10cm）、24孔板、12孔板、6 孔板、9孔板、0.45um滤膜

o 试剂准备（REAGENT SETUP）

LB:已经灭菌的新鲜LB(无抗)；

氨苄青霉素（1000X）：用ddH2O配制成终浓度为100mg/mL，用0.22um滤膜过滤后

分装；

嘌呤霉素：根据需要的浓度自行配制。

o 器械（EQUIPMENT）

EP管、冻存管、离心机、细胞培养箱、-80℃冰箱

实验步骤（PROCEDURE）

shRNA敲低细胞系►预期时间消耗：两个星期间断性实验
1．细胞嘌呤霉素浓度确定实验：

a．24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；

b．准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；

c．细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；

d．约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

e．每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间；

f． 最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

1. 在我院shRNA库中查找有没有所需基因的shRNA,一般会有4-5条，将shRNA信息复制另存到excel表格中，[[1]]；

3．拿到shRNA后加入LB摇菌小抽后继续转化后中抽，得到浓度较高的质粒；

4．第一天晚上接种 293T 于6孔板，每孔接种70-80%（1×106个），并加入2ml培养基，每种 shRNA对应一孔；

5．第二天早上转染质粒：2ug shRNA, vsv-g 1ug， gag 2ug， Rev 2ug，lip2000 18ul；

6．第三天早上弃上清，加入1ml完全培养基；

7．第四天吸出含病毒的培养基上清液，4000rpm/min 离心 5min，吸上清用0.45um滤膜过滤后放入无菌的EP管中，-80℃保存(可保存六个月)，也可马上使用；

8．第三天的时候可同时将目的细胞接12孔板，密度大约为5X105/ml；

9．第四天将12孔板中培养基上清去除，加入病毒上清1ml，感染6h后补加1ml新鲜培养基；

10．第五天更换筛选培养基，第七天换液（利用含有嘌呤霉素的培养基筛选）等细胞长满后将细胞移至6孔板，继续加入嘌呤霉素维持，此为瞬敲细胞系。

11．稳敲细胞系（筛选时嘌呤霉素浓度不变）是将瞬敲得到的细胞稀释成10 cells/ml,转移至96孔板中培养，每孔100ul(大约每孔1个细胞）；

12．18-24h后，观察每孔的细胞数，将只有一个细胞的孔做上标记；

13．观察做标记的孔形成的克隆数，只形成1个克隆的被认为是单克隆；

1. 持续观察确认孔中克隆数，当96孔板中的单克隆达到较高密度时，转移至12孔板培养；

15．细胞在12孔板中达到较高密度时，转移至6孔板中继续培养，同时取少量细胞鉴定效果（western blot 或QPCR）；

16．确认表达后，将单克隆转移至10cm培养皿中培养，一般需要2-4周细胞才能达到较高密度；

17．冻存细胞（冻存液不含抗生素）；

18．稳转细胞系建立以后，可降低抗生素浓度（如降成原来的一半）。

▲关键步骤：不同的细胞种类对于接板时细胞数以及抗生素的浓度的选择不同，需要自己摸索或者请教师兄师姐。

siRNA敲低细胞系 ►预期时间消耗：两个星期间断性实验
（以下步骤所有的量和浓度都是以孔为基础）

1．转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到 30~50％ (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)，请使用无抗生素的培养基；

2．对于每个转染样品，按照如下操作准备 lip2000�siRNA 混合物：

a． 稀释转染试剂 lipo2000：使用前，将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取 2ul，用 100ul 不含血清的 Opti�MEM 稀释，轻轻混和，室温孵育 5min；

b．稀释 siRNA：用 100ul Opti�MEM 稀释 40pmol 的 siRNA，轻轻混和；（对于 stock 浓度为 20uM 的 siRNA，加 2ul 即可）

c．稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后，与上述(b)稀释好的siRNA 轻轻混和，室温培养20min 以形成siRNA�lipo2000混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。

3．将 siRNA�lipo2000 混合液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和；

4．将培养板置于 37 ℃的 CO2 培养箱中培养至检测时间(24~96h)。沉默效率的检测一般建议的时间为 24~72h。

▲关键步骤：转染操作完成，经过 37℃培养 4~6h后，可以将孔里含有 siRNA�lipo2000 混合液的培养基移去，更换新鲜培养基，这样也不会影响转染的效率。注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基(即血清饥饿的条件下进行转染)，4~6h 后必须换成完全培养基(含血清、含抗生素)，以确保细胞生长。

CRISPR/Cas9敲低细胞系 ►预期时间消耗：两个星期间断性实验

1. 通过软件设计基因的sgRNA并送到公司合成；
2. 拿到的sgRNA(上游，下游)需要复性，体系： sgRNA（F 100μM） 2μl，sgRNA（R 100μM）2μl ，NEB buffer2（sigma）2μl，ddH2O 14μl 95℃放置5min，然后自然冷却至室温；
3. cas9载体质粒酶切，体系：cas9载体质粒5μg，bsmb1内切酶3μl，FastAP 3μl，buffer

6μL ，ddH2O补齐至60μl在37 ℃放置30min，然后0.8%核酸胶跑胶，可以看到两条带，分子量大的那条胶回收；

1. cas9质粒酶切后回收产物和复性的sgRNA连接，使用T4连接酶，用量和步骤见T4连接酶说明书，连接产物转化，挑点摇菌，鉴定后测序抽质粒；
2. 得到的质粒与shRNA敲低方式相同。

▲关键步骤：酶切需要彻底，并且需要设计出具有敲除效果的sgRNA。

针对性建议（TROUBLESHOOTING）

1. 细胞系敲低时细胞状态不稳定会在感染时大面积死亡，所以无论是293T还是目的细胞状态都需要非常良好；
2. 对于抗生素浓度以及病毒滴度最好能事先做一下预实验确定；
3. 重复检测具有敲低效果的细胞系需要马上冻存保种避免重新筛选，这一点很重要；
4. 慢病毒包装得到的病毒最好现用，放于-80℃冰箱的病毒上清应避免反复冻融。