集落形成实验

集落（克隆）形成实验是检验细胞存活率和增殖能力的有效指标。集落或克隆是指单个细胞在体外经6代以上增殖后所形成的细胞群体，直径大小常在0.3-1.0mm左右。正常细胞在体外培养时由于常需附着在坚硬的玻璃或塑料表面才能生长，而转化的或恶变的肿瘤细胞却常常丧失附着依赖生长的特性，可在软琼脂或甲基纤维素中以集落的方式生长。通过对集落的计数，不仅可以了解细胞的生存增殖能力，而且还可用于评价肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性、肿瘤放射生物学研究。
常用的集落形成实验主要有平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验，此处主要介绍软琼脂集落形成实验。
（一）仪器、用品与试剂
超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、24孔细胞培养板、吸管、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、琼脂粉等。
（二）操作步骤
1．制备细胞悬液：取对数期生长贴壁细胞经消化、洗涤后用培养基根据实验要求稀释调整细胞密度，待用。
2．制备底层琼脂：用三蒸水配制5%的琼脂，高压灭菌后待温度降至50℃，加入预温的9倍体积培养基稀释，混匀后迅速给24孔培养板每孔中加入0.8ml，室温凝固琼脂。
3．制备上层琼脂：取0.6ml保温于50℃的5%的琼脂与9.6ml细胞悬液迅速混匀后立即加入到铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，室温凝固琼脂。
4．将培养板置细胞培养箱中培养7～14天。
5．倒置显微镜下计数集落数目，按下面公式计算结果。
集落数＝n个孔的细胞集落数总和÷孔数（n）
集落形成率＝（集落数÷接种细胞总数）×100％
（三）注意事项
1．制备琼脂凝胶时尽量避免气泡和局部结块的产生。
2．琼脂与完全培养基混合温度不要超过50℃，与细胞悬液混合时的温度不要超过40℃，以免降解培养基的营养成分和损伤细胞。