ELISA原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是应用酶标记的抗体（或抗原）在固相支持物表面检测未知抗原（或抗体）的方法。酶与抗体（或抗原）交联后，再与集合结合在固相支持物表面的相应抗原或抗体反应，形成酶标记抗体-抗原复合物，此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物液体后呈现显色反应，液体显色的强弱和酶标记抗体-抗原复合物的量成正比，借此反映出待检测的抗原或抗体量。

酶联免疫吸附试验是利用抗原-抗体的免疫学反应和酶的高效催化底物反应的特点，具有生物放大作用，所以反应灵敏，可检出浓度在ng水平。在免疫反应部分，抗原-抗体的亲和力、抗原和半抗原的性质、测定方法的实验条件、酶标记物的性质等因素影响反应的敏感性。在酶学反应部分，酶的浓度、底物的浓度、反应pH和温度、酶的抑制剂和激活剂等因素液影响反应的敏感性。

酶联免疫吸附试验中所使用的试剂都比较稳定，按照一定的实验程序进行测定实验结果重复性较好，有较高的准确性。酶联免疫吸附法成本低，操作简便，可同时快速测定多个样品，不需要特殊的仪器设备。ELISA法测定技术与其他技术结合发展成为专门的分析方法，如与电泳技术结合的免疫印迹技术，与层析技术结合的层析-ELISA技术等已成为生物实验室的常规技术。

用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。

在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?.0。

HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。

国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000，酶作用的最适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，最适pH为9.6。在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。